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如何使用聚乙二醇獲得高質(zhì)量純化質(zhì)粒

發(fā)布時(shí)間: 2023-12-04  點(diǎn)擊次數(shù): 660次

 

都知道大量提取的質(zhì)粒DNA一般需進(jìn)一步純化,常用柱層析法和氯化銫梯度離心法。常使用的所有純化方法都利用了質(zhì)粒DNA 相對(duì)較小及共價(jià)閉合環(huán)狀這樣兩個(gè)性質(zhì)。例如,用氯化銫-溴化乙錠梯度平衡離心分離質(zhì)粒和染色體DNA 就取決于溴化乙錠與線狀以及與閉環(huán)DNA分子的結(jié)合量有所不同。但是此類方法也存在了一些例如使用化學(xué)物質(zhì)誘導(dǎo)質(zhì)粒突變的弊端,所以新的純化方式的摸索很有必要的。

 

其中很好的方法,也應(yīng)是聚乙二醇分級(jí)沉淀法。首先我們了解一下什么是聚乙二醇(PEG),聚乙二醇是一種高分子聚合物,化學(xué)式是HO(CH2CH2O)nH,無(wú)刺激性,味微苦,具有良好的水溶性,并與許多有機(jī)物組分有良好的相溶性。


 

PEG為一種非離子多聚物,多離子多聚物是六十年代發(fā)展起來(lái)的一類重要沉淀劑?;诙嗑畚锏某恋碜饔弥饕蕾囉诙嗑畚锏臐舛群捅怀恋砦锏姆肿恿看笮。琇aurent等(1967)提出PEG的沉淀機(jī)理主要是通過(guò)空間位置排斥,使液體中的微粒(包括生物大分子、病毒和細(xì)菌等)被迫集聚在—起而引起沉淀的發(fā)生。PEG最早應(yīng)用于提純免疫球蛋白(IgG)和沉淀一些細(xì)菌病毒,后來(lái)逐漸應(yīng)用于核酸和酶的分離純化,特別是用PEG分離質(zhì)粒DNA,已相當(dāng)普遍。


 

 

 

那么如何利用PEG進(jìn)行質(zhì)粒純化呢?

下面介紹一下PEG純化質(zhì)粒的一般操作步驟:

  向質(zhì)粒溶液中加入等體積的用無(wú)菌的1.6M NaCl配置的13% w/v PEG 8000;

  將試管內(nèi)的物質(zhì)渦旋充分混勻,然后-20°C孵育1 h至過(guò)夜

  最高轉(zhuǎn)速 4°C離心30 min;

  輕柔吸取去上清,收集沉淀;

  用500 μl 70% 乙醇沖洗顆粒,并短暫渦旋;

  最高轉(zhuǎn)速 25°C離心5 min,去除70% 乙醇;

  再次離心去除酒精,干燥沉淀后溶解。


 

該操作的優(yōu)點(diǎn)在于:操作條件溫和,不易引起生物大分子的變性。同時(shí)具有很高的沉淀效能,少量的PEG可以沉淀相當(dāng)多的生物大分子。

 

 

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